第三节　特殊毒理学试验

中药中许多提取成分随着药效的增加其毒性也随着加大，因此，有些药物要进行特殊毒理试验。其试验内容可包括致突变作用、致癌作用和生殖毒性等，即所谓“三致”作用。其实，特殊毒理学的研究范围尚可包含致敏和依赖性等内容。遗传毒理学是近20年才逐渐发展起来的一门较为年轻的新兴学科，与具有较长历史经验和知识积累的一般毒理学相比较，更显得需要进一步发展完善和提高。对于中药在特殊毒性试验中获得的结果，无论是否定的或是肯定的结果，都应进行科学和冷静地全面分析，尽量避免作出盲目性与武断的结论。有关致突变、致癌和生殖毒性试验的方法本节不做详细介绍，本节只介绍相关特殊毒理的各国研究内容及方法学进展。

在20世纪60年代发生引人注目的药物悲剧“反应停”事件以前，国外对新药临床前毒理学评价一般仅要求提供新药的急性、亚急性或慢性毒性试验资料。此后，美国于1962年首先制定了药物致畸胎试验的特别条例，各国也相继加强了要求与管理。药物特殊毒性评价，尤其是遗传毒性试验，不像一般毒性试验被人们较早地认识与接受。这主要是由于受某些学科的发展与技术进步所限。随着50年代以来人们对DNA结构、DNA复制、基因密码、蛋白质合成机制以及DNA修复过程等的基础和实验研究所取得的进展，为遗传毒理学和致突变物的检测等提供了可靠的理论和技术基础。60年代以来，检测诱变剂或致癌剂的短期试验方法相继建立，特别是1975年Ames创立的细菌诱变试验问世，使得对大量化学物质及一些有毒中药成分进行诱变性检测成为可能。研究结果显示，大量的致癌剂及一些抗癌中药成分具有诱变性，或者说许多诱变剂具有致癌性。突变性与致癌性之间有良好的相关性。继之而来的一些研究显示，某些药物本身就是诱变剂或致癌剂。例如某些抗肿瘤药、抗生素、抗癫痫药、抗精神病药、解热镇痛药和抗寄生虫药等。海恩酮和己烯雌酚以及雷公藤、细辛挥发油、黄樟醚、半夏、板蓝根、喜树、花椒等均可引起染色体畸变就是具体例证。这些事实使得药物毒理学专家及有关管理部门大为警觉。70年代后期，世卫组织（World Health Organization，WHO）、欧洲经济共同体（Commission of the European Communities，EEC）及经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）等制订了新药管理法或试验指南，其中不仅包括一般毒性试验，更把特殊毒性试验列入临床前安全评价内容。由于新药的研制与开发具有周期长、耗资大、成功率低等特点，各国对新药临床前毒理评价的要求（包括试验项目与时机等）都有所侧重或差异。而且随着时间的推移、经验的积累、认识的深化及毒理学自身的发展等，各国都在不断修改和完善新药安全性评价的要求。就遗传毒性试验而言，中国和主要工业化国家都有较为明确和具体的要求。各国对新药遗传毒性试验项目的要求是很相近的。当然，从学术观点看，无论从试验战略、项目要求到试验程序等都存在着多种观点与建议。但各国都必须在此基础上，权衡利弊和考虑诸多因素形成本国的规定或指南。

值得指出的是，美国食品药品管理局（Food And Drug Administration，FDA）对新药的致突变性试验并未提出明确的要求，但不能简单地理解为FDA不需要对新药进行致突变性试验。相反，由于没有像其他各国一样规定明确的试验项目，反而增加了某些不确定因素。

一、关于生殖毒性试验

通常包括生育力与早期胚胎发育毒性试验（Ⅰ段）、胚胎-胎仔发育毒性试验（Ⅱ段）、围生期毒性试验（Ⅲ段），视情况还可设计子代的多代观察。Kirkland（1993）对美国、日本、加拿大和欧共体的新药生殖毒性试验要求进行表格化比较^［4］。在各国的要求中存在着不少差异，如给药的时机、期限以及对母体的剖检和子代的观察等，各国都希望能有一个统一协调的指南来规范试验要求，以节省经费和避免由各国的差异而带来的重复（适应对方的规定）。有人认为，生殖毒性试验的基本原理与原则并不存在大的分歧，协调各国的要求恐怕首要的是商业利益上的考虑。虽然各国在某些方面，如动物种类、数量等方面存在一些差异，但试验原则是大体相近的。然而，在对待进行生殖毒性研究的新药类型上，不同类型各有所侧重。例如美国早在20世纪60年代就发布了生殖毒性试验指南，并强调儿童用药必须进行此项试验，非全身吸收用药或老人专用药则不必做此项试验。日本则认为原则上所有新药均应进行三段生殖毒性试验，必要时还有附加要求。例如，测定药物在母体、胎儿器官组织和血中浓度或乳汁中的代谢等，显示日本的要求是更为严格的。加拿大则指明对老年用药不需生殖毒性试验。

二、关于新药的动物致癌试验

欧、美和日本各国的指南中均有相应的要求。然而，由于众所周知的原因，即对传统的动物致癌试验人力和物力的投入巨大，故对新药的致癌试验都极为谨慎，各国对需进行致癌试验新药都提出了相应的前提条件。这些前提条件各国虽有所差异，但归纳起来下列各因素是进行致癌试验时必须充分考虑和权衡的：化学药及有毒中药在化学性质上与已知致癌剂有关，其代谢物与已知致癌剂相似；在重复给药或长期毒性试验中具有细胞毒性作用，包括影响细胞有丝分裂或某些脏器、组织细胞异常显著活跃；需长期使用的药物（无论连续或间断使用6个月以上者）；致突变试验为阳性结果的新药；能产生某些特殊的生物活性物质等。上述各项考虑的是进行致癌试验的新药自身毒理或药理特点。

事实上各国对致癌试验也有一些附加的考虑。例如，加拿大的指南就提出，对用于晚期癌症患者的抗肿瘤药物不必做致癌试验。日本亦认为对于仅局限于某些靶器官的疾病，且该新药对此种疾病有高度疗效者亦不拘泥于上述考虑，也可不做致癌试验。

关于动物致癌试验的具体要求，各国的指南中均有相应的规定。从要求的主要内容显示，各国指南中的要求基本一致或相近，不存在原则性的差别。例如，对动物种属的要求，各国通常首选大、小鼠或仓鼠，其理由是这些动物容易繁殖及饲养，选择这些动物进行试验的理由是显而易见的。仅加拿大提出有时可采用犬、灵长类或其他动物。对动物数量及性别（大、小鼠）均建议每一组用不同性别动物各50只。其他诸如对照组的设置（含赋形剂或溶媒对照）、实验期限的要求、给药途径和剂量水平的设计等虽有一定差异，但原则上大多是一致或相近的。

给药途径应与人体拟用途径一致或尽可能一致。动物管理按GLP要求，实验因素以外的动物损失小于10%，对动物饲料也有明确要求。值得指出的是，我们在看到各国对新药特殊毒性试验要求在总体上的一致性或相似性的同时，也不应忽视各国之间在指导思想和具体试验要求上的差异。这些差异往往导致本国的新药进入另一国家市场受阻或不得不花费人力物力重新试验以适合该国要求，此时这些差异就显得特别重要和有意义。尤其是我国中药面临走向国际市场的新形势，了解各国对新药研究特殊毒理学试验的内容和要求就显得尤为重要。

三、致突变性试验

遗传毒理学试验长期使用细菌回复突变试验（recovery mutation test of bacteria）、小鼠睾丸染色体畸变试验（chromosome aberration test in mouse testis）、小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变（chromosome aberration test of mouse spermatocyte or spermatocyte）、哺乳类细胞培养染色体畸变（mammalian cell culture chromosomal malformation）试验以及整体动物的微核试验等。细菌回复突变试验常用的为鼠伤寒沙门菌营养缺陷型回复突变试验，通常简称为Ames试验；哺乳类细胞培养染色体畸变试验用细胞遗传方法检测药物是否影响细胞遗传结构DNA或改变信息的实现过程，从而判定药物的遗传毒性；整体动物（啮齿动物）的微核试验是药物致突变试验中唯一的一项体内试验，它是细胞培养染色体畸变试验的一项补充和验证。因此，微核试验虽然技术上并不复杂，但它在评价药物的致突变时，与体外试验的细菌诱变和细胞染色体畸变试验组合成为一套较为科学合理而完整的评价系统。

1.细菌回复突变试验

通常简称为Ames试验，它是1975年由Ames本人完整地提出用微生物检测致突变物的方法，是目前检测基因突变最常用的方法之一。试验用菌株为鼠伤寒沙门菌不同组氨酸缺陷型突变株，根据致突变物能灵敏而特异地使组氨酸缺陷型突变株回变成野生型的特点，故在缺乏组氨酸的培养基上，只有少数自发回变菌落生长。而能诱发细菌回变的致突变物可使细菌生长增多，从而可判断被试物是否具有致突变性。但是，试验用的培养基中，并非真正完全不含组氨酸，它仍含有少量组氨酸。这样，营养缺陷型的细菌才能繁殖数代成为菌苔，同时使诱变物所产生的DNA损伤在复制过程中转变为突变，突变又表现为功能基因产物，只有这样的回变细菌才能进一步生长成菌落。回复突变是某些特定基因座的突变，通常用带不同基因的一套菌株进行试验。Ames（1975）最初推荐的一套菌株为TA100、TA98、TA1535、TA1537和TA1538。但实践表明，上述菌株对某些结构类型的化学物如醛类、过氧化氢及交联剂等难以检出。故于其后（1983）又推出另一套菌株，即TA97、TA98、TA100和TA102四株菌作为一套标准测试菌株，我国规定使用的菌株与此相同。

目前有关细菌回复突变试验研究进展主要是在适合GLP的规范化研究上。适合GLP的试验与为研究而实施的试验相比，明显的不同在于它是在指南的基础上，根据标准操作规程（standard practice instructions，SOP）规定，从操作程序计划到最后完成报告书等都要实施管理。适合GLP的试验实施上最主要考虑的是关于SOP，SOP重点是对设施管理、试验实施（试验操作、记录、结果判定等）的计划、最终报告书、质量保证的监督检查、培训等。试验因为遵循指南和GLP原则，所以能得到可信度高的资料。该试验经常出现的问题是：中药提取物样品处理不当；除了设阳性物对照组外，应当考虑增设溶剂对照。另外，灭菌也很重要，温度低了，样品芽孢杆菌不能杀灭，故容易出现假阳性结果，剂量设计最高剂量为5mg，组距为等比或等差。

2.哺乳类细胞培养染色体畸变试验

检测药物是否影响细胞遗传结构DNA或改变信息的实现过程，从而判定药物的遗传毒性，是比较成熟和可靠的方法之一。可用于染色体分析的细胞包括人类和动物细胞等。可分别用体细胞或生殖细胞进行。前者可用骨髓细胞、外周血淋巴细胞和动物某些器官组织细胞来代表体细胞。后者以雄性动物的精原细胞和初级精母细胞作为生殖细胞的代表。

上述不同类型细胞各有其特点，在研究工作中能为我们提供适应研究目的所需的材料。然而，在新药的染色体畸变试验中，要求用哺乳动物培养细胞做染色体畸变试验，并建议首选中国仓鼠肺细胞（Chinese hamster lung cells，CHL）。这当然不是说其他类型的细胞不能用于药物的遗传毒理研究。显而易见的原因是，以细胞株的单层细胞培养物进行遗传学分析有其优点。首先，在细胞分裂周期时间、染色体数目和克隆形成率等参数上一致；其次，细胞株可以冷冻长期保存，使用时可以复苏并传代，甚为方便。

可用于体外细胞培养染色体畸变分析的细胞系株有多种，但最常用的有中国仓鼠卵巢细胞系（Chinese hamster ovary cell line，CHOCL）、中国仓鼠肺成纤维细胞系（Chinese hamster lung fibroblast cell line V79，V79 和 CHL）和人胚肺二倍体成纤维细胞等。从世界各国情况看，CHL与V79细胞使用频率最高，这些细胞株具有世代时间短（一个世代为12～14小时）、染色体数目较少（2n=22或25）和核型稳定等特点，均不失为研究工作中的良好材料。另外，1997 年人用药品注册技术要求国际协调会（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）提出了用哺乳类动物细胞的基因突变试验（gene mutation test in mammalian cells，GMC）小鼠淋巴瘤基因突变试验（lymphoma gene mutation test in mice，LMM）代替染色体畸变试验，并得到认可。MLA是1978年由Clive和Moore等开发的以小鼠淋巴瘤L5178Y胸苷激酶基因（tk）为目的基因的突变试验。该试验法与以往的基因突变检测法不同，它的最大特征是不仅可以检出点突变等小的DNA变异，还能检出染色体水平的较大DNA缺失以及染色体之间重组引起的变异。为此，在理论上可以覆盖此前的Ames试验检测的诱变剂（mutagen）和染色体畸变试验检测的断裂剂（clastogen），即作为广谱（wide-spectrum）的基因突变检测法而受到重视。另外，这里可以检测的所有突变还对应于人的肿瘤组织观察的肿瘤基因和肿瘤抑制基因的突变，为细胞癌变过程基因变化的模型。MLA法已经在美国和欧盟作为染色体畸变试验的代替法得以应用，目前在我国和日本还开展得不多。为使我国在中药的遗传毒理学评价方面与国际接轨，有必要在国内尽快推广tk基因突变试验方法。

3.整体动物的微核试验

目前体内遗传毒性试验最为常用的是啮齿类动物微核试验。与其他的体内试验系统相比，由于该试验的方法较简便，积累了较多数据，并且基本上建立了标准的操作规程，因此确立了其作为常规试验方法的地位。最初，微核试验使用的是骨髓材料，而最近的研究显示，使用末梢血也可以进行相同的评价^［3］，因而遗传毒理学的评价变得愈加简便。

通常，微核试验是通过观察幼红细胞来检测骨髓嗜多染红细胞产生的染色体的变化，因此使得骨髓以外器官为靶器官的物质的检测受到限制。例如，有名的致肝癌化合物（diethylnitrosamine）在微核试验中便是阴性。近年虽开发了使用肝脏和皮肤等器官的微核试验方法，但还处于未普及阶段。在这一背景下，国际上相继开发了具有能够检测所有脏器之优点的新方法——转基因小鼠基因突变检测系统。该方法是将大肠埃希菌lacI、lacZ等基因连接于噬菌体等载体上，导入小鼠体内，通过噬菌体包装从所有脏器回收靶基因，再使用大肠埃希菌进行突变检测。最近由于方法的改进，评价变得更为简单，因此逐步得到了普及。随着数据的积累，其适用性也在得到确认，今后可以期待其作为微核试验的补充方法得到进一步的应用。为此，与微核试验一样，须建立标准的试验操作规程，目前国际上在IWGTP（International Working Group for Technical Protocol）等组织正在进行协调。

近年随着分子生物学的进步，遗传毒理学领域新技术方法的研究和开发也非常活跃。过去，在管理体制下基于已经建立的方法及其试验结果进行遗传毒性的判断。但是，随着人的基因多样性研究的不断深入，今后会更进一步发展。