第三节　肠道微生物功能研究方法

肠道微生物群与人体存在着共进化、共发育、共代谢、互调控的相互作用，对人体健康有着极其重要的影响。随着肠道微生物群领域研究的整体深入，研究人员希望可以掌握肠道微生物群在不同生理状态下的整体状态，包括群落成员互作、群落整体变化趋势和代谢情况等。基因组学、转录组学和蛋白质组学等越来越多地被应用于肠道微生物群的研究中，开启了所谓的“组学”时代。

一、宏基因组学分析

宏基因组学（metagenomics），亦称元基因组学，最早由Handelsman于1988年提出，是从环境样本中直接提取基因组DNA并进行功能基因筛选或测序分析的一种研究方法，规避了对研究对象的培养。宏基因组学分析方法是比较和探索复杂环境微生物群落的生态学和代谢谱的有力工具，并且可以通过由分离提取的核酸构建的文库鉴定新的生物分子。二代测序技术的出现，例如焦磷酸测序或illumina测序等推动了测序行业的发展，可以快速且有效地对来自宏基因组文库的目的克隆的插入序列进行测序，也可以直接对生态系统的宏基因组DNA含量进行鸟枪法测序。宏基因组学和人类微生物组学已经走在生物学的最前沿。美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）于2007年启动了“人类微生物组计划”（Human Microbiome Project，HMP），欧盟于2008年启动了“人类肠道宏基因组计划”（M etagenomics of the Human Intestinal Tract，MetaHIT），中国也作为重要成员参与其中。

肠道微生物组含有的基因数多于人类自身基因的100倍，被称为人体的“第二基因组”。宏基因组学揭示了肠道微生物群的多样性和复杂性，以及其对人体健康状态的重要影响。目前大量的研究结果支持人体的健康或疾病状态与肠道微生物群有着密切关联，可见深入开展人体肠道微生物组研究对于理解肠道微生物群与人体相关疾病之间的因果关系和可能机制至关重要。宏基因组学分析揭示了肠道微生物群的“生态失调”，包括群落结构改变、群落成员的增加或缺失等现象，与多种疾病有关。

值得注意的是，宏基因组学分析包括一种称为功能宏基因组学的研究方法，可对影响代谢和人类健康的微生物组的功能组分进行分析。2010年，Tasse等将功能宏基因组学应用于人体肠道微生物组，发现了73个能够降解碳水化合物的细菌酶，实现了对人体肠道微生物组的碳水化合物水解酶信息的首次全面解析。目前功能宏基因组学已被应用于肠道微生物组中一些分解代谢酶的筛选，以及反映宿主和微生物共同进化相关的人类肠道微生物群（移动宏基因组）移动质粒编码元件的筛选等。

为了进一步研究肠道微生物群特定环境微生物群落的功能动态，元转录组学和元蛋白质组学被开发。对于特定环境中存在的微生物群落的基因组DNA，转录组和蛋白质组的组合分析是阐明微生物群落的组成，功能和相互作用的一种更为全面的方式，相信相关组学的整合也会发掘出更多有价值的信息。

二、代谢组学分析

对于一个个体的肠道微生物群来说，它的生态功能部分体现在对宿主代谢功能的影响上。了解宿主代谢的变化也有助于了解肠道微生物群的作用。个体整体的代谢水平是由机体自身基因和肠道微生物组指导的代谢活动的整合。肠道微生物组可以参与并调节宿主代谢反应，胆碱、胆汁酸、酚类和短链脂肪酸等产物的产生是宿主健康的基础。

代谢组（metabonome/metabolome）是对同一时间点或某一段时间内复杂生命系统或特定生物样品中所有低分子质量＜1 000的代谢物的定量描述。代谢组学（metabolomics）被定义为：定量测量复杂（多细胞）系统对病理生理干预或遗传修饰的多参数时间相关代谢反应，对生物体或特定生物样品的所有代谢物进行的全面鉴定和定量分析。代谢组学旨在定量分析生化反应中的底物分子或产物分子（代谢物），其主要捕获生命系统中内源性和外源性的小分子的相关信息。随着相关技术的发展，目前研究肠道微生物群的常用样本范围扩大，包括血液，尿液和粪便水等生物体液和组织样本中微生物群和宿主细胞产生的代谢物。

宏基因组学和宏转录组学等更多关注肠道微生物组的代谢潜力。代谢组学较其他研究手段，除了揭示不同生理状态下肠道微生物群的整体代谢情况，还可以回归关注宿主本身的代谢水平变化，反映肠道微生物群对其宿主代谢的影响。

代谢组学分析实时提供个体的整体代谢水平谱，可以阐明在特定疾病状态中肠道微生态发生的复杂改变，反映疾病状态与肠道微生物群的关联，已被用于许多疾病的研究，包括消化道疾病如炎性肠病、结直肠癌、肠易激综合征，以及非消化道疾病如非酒精性脂肪性肝病等。代谢组学分析还广泛用于疾病相关生物标志物的筛选和鉴定。

代谢组学在与肠道微生物群和脑相关的神经活性小分子代谢物的发现和定量方面也有很好的前景，相关的小分子代谢物包括5-HT、色氨酸分解代谢物、胆汁酸、SCFA、多不饱和脂肪酸、氨基酸神经递质和儿茶酚胺等。很多证据表明，小分子代谢物可能在调节微生物对神经传递和疾病发展的影响方面发挥关键作用。基于质谱的代谢组学适用于在肠道微生物群和脑之间的双向通信过程中获得代谢信号，在揭示肠道微生物群与宿主脑之间的关联方面的潜力。

代谢组学在研究复杂肠道微生物系统的功能和代谢方面具有巨大的潜力。将宏基因组和代谢组学信息整合，将能够更好地理解肠道微生物组与宿主代谢之间的相互作用。通过这些相互作用进行建模，对肠道微生态系统进行基于组学的综合理解有望提供针对某些疾病的新型治疗方法。

（郭晓奎）