第一节 肠道细菌与天然免疫系统的相互作用
组织屏障（皮肤和黏膜系统、血脑屏障和胎盘屏障等）、固有免疫细胞（吞噬细胞、杀伤细胞和树突状细胞等）、固有免疫分子（补体、细胞因子和酶类物质等）构成先天免疫系统，这是抵御病原体感染的第一道防线。在肠道内，中性粒细胞和巨噬细胞通过模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）控制肠道微生物，并识别和响应微生物结构的变化。PRR识别微生物相关分子模式（microbe-associated molecular pattern，MAMP），主要包括肽聚糖、鞭毛蛋白、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和微生物的核酸结构。一些来自食物发酵的细菌代谢物也可被PRR识别，如丁酸盐。PRR通过保守的分子结构识别微生物，这些结构包括Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR）、视黄酸诱导基因1样受体（retinoic-acid-inducible gene I-like receptor，RLR）和C型凝集素受体（C-type lectin receptor，CLR）等。它们和下游的胞内分子共同构成了一个持续监测肠道微生物存在的系统。PPR被认为是天然免疫系统中不可缺少的组成部分，同时它们也可参与获得性免疫反应。
（一）TLR与肠道微生物群的相互作用
肠上皮细胞通过表达识别共生细菌的MAMP调节肠道微生物和宿主之间的相互作用。在MAMP识别后，TLR形成一个同源二聚体或异源二聚体，用以招募同样含有TLR结构域的衔接蛋白，然后激活下游的相关转录因子，这些因子包括核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）、蛋白1激活剂、干扰素调节因子3（interferon regulatory factor-3，IRF-3）和IRF-7等。TLR在肠上皮细胞的表达情况如图4-1所示。TLR介导的信号传导可导致天然免疫细胞活化，产生两方面效应，其一，表达和分泌多种称之为促炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-12、IL-6，诱导炎症发生，促进抗原提呈，促进辅助性T细胞（helper T cell，Th cell）分化为Th1或Th2细胞；其二，可诱导共刺激分子表达，启动特异性免疫应答产生。
迄今为止，已经确定的TLR有13个，其中了解比较清楚的有TLR2、TLR4、TLR5和TLR9。人的TLR家族基因定位分别定位于4号染色体（TLR1、TLR2、TLR3、TLR6及TLR10）、9号染色体（TLR4）、1号染色体（TLR5）、3号染色体（TLR9）和X染色体（TLR7、TLR8）。根据TLR细胞分布特征，可将其分为普遍存在型（TLR1）、限制存在型（TLR2、TLR4、TLR5）及特异存在型（TLR3）3类。根据染色体的位置、基因结构和氨基酸序列，人的TLR受体可以分为5个亚科，即TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9。TLR2亚科有TLR1、TLR2、TLR6和TLR10；TLR9亚科有TLR7、TLR8和TLR9；另外TLR3、TLR4和TLR5各自形成一个亚科。人体肠道微生物群的构成受不同TLR及其结合蛋白的状态的影响。TLR信号缺陷和对干扰肠道微生物群的异常免疫反应是导致IBD患者炎症和组织损伤持续存在的主要因素。抗生素的干预可上调小鼠回肠TLR4、TLR5、TLR9和结肠TLR3、TLR4、TLR6、TLR7和TLR8的表达水平，而回肠TLR2、TLR3、TLR6和结肠TLR2和TLR9的表达水平在抗生素处理后降低。在葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的结肠炎小鼠模型中，TLR2和TLR4的表达上调，而TLR5的表达水平下降，其他TLR的表达保持不变。因此，在疾病条件下TLR模式的显著变化可能从一定程度上表明TLR成员的分化功能。
TLR1的主要配体为细菌中的脂蛋白和三酰脂质肽。有报道显示TLR1对微生物群的先天识别可促进上皮内环境稳定并防止慢性炎症，在小肠感染过程中发挥着关键的作用。如果TLR1对微生物群的识别缺失，会导致隐窝内稳态的破坏，特别是黏液层的缺失、结肠中的帕内特细胞（Paneth细胞）数量增加、细菌易位、炎症增加并恶化。由此证明TLR1对微生物群的感知可能是调节结肠上皮功能的关键信号，从而通过预防细菌黏附来限制炎症发展。
TLR2的配体包括脂蛋白、脂多肽、脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）、脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）及酵母多糖等。TLR2在肠道神经元和平滑肌细胞中表达，并感知细菌、支原体、真菌和病毒的各种成分，在宿主抵御感染中发挥关键作用，同时也可调节肠道黏膜血清素的生成。一些益生菌或肠道共生菌可通过TLR2信号抑制病原菌及病毒感染。例如，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）通过TLR2途径促进小鼠骨髓树突状细胞表达抗病毒基因，如黏病毒抗性蛋白1和β干扰素（interferon-β，IFN-β）。另一项研究发现德氏乳杆菌亚种（L.delbrueckii TUA4408L），可通过调节TLR2减轻猪肠黏膜上皮细胞（intestinal epithelial cell，IEC）对肠毒性大肠埃希菌987p的炎症反应。婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）可通过树突状细胞（dendritic cell，DC）所表达的TLR2/TLR6途径上调抗炎细胞因子IL-10的分泌。脆弱芽孢杆菌的多糖A可以激活TLR2并促进IL-10的分泌。但是，在炎性疾病中TLR2信号可诱导NF-κB的活化，促进Th17细胞反应，进而增强炎症反应。因此，TLR2信号可以同时诱导炎症反应和抑炎反应。
TLR3特异识别病毒复制的中间产物双链RNA，从而激活NF-кB和IFN-β前体。Doyle S E等证实，抗TLR3单克隆抗体能抑制成纤维细胞IFN-β的产生。Christopher A等证实TLR3还具有调控鼻病毒对人支气管细胞感染的能力，这也说明了TLR3在宿主抵抗活病毒中发挥重要的作用。TLR3对肠道病毒的识别可上调下游IFN-β的产生进而改善肠道炎症。在肿瘤动物模型中，TLR3可调节自然杀伤（natural killer，NK）细胞对细胞因子的反应并控制肺癌细胞的迁移，因此TLR3的激动剂是一种很有前景的癌症疫苗佐剂。
TLR4可以识别革兰氏阴性菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），还可识别宿主坏死细胞释放的热休克蛋白（heat-shock protein，HSP），体内类肝素硫酸盐和透明质酸盐降解的多糖部分及局部的内源性酶的级联活化反应也可激活TLR4。TLR4被称为“位于营养、肠道微生物群和代谢炎症的十字路口”。因为肠道微生物群的变化可导致肠屏障的完整性降低，导致LPS和脂肪酸过量进入体内，这可作用于TLR4，激活全身炎症。而脂肪酸也能触发内质网应激，通过与活性TLR4的相互作用进一步刺激内质网应激。因此，目前的数据支持代谢性炎症的三个主要触发因素均与TLR4密切相关。此外，在肿瘤中，肠道微生物群还可通过刺激TLR4介导的M2型巨噬细胞极化，促进结直肠癌的肿瘤转移。TLR4介导肠道炎症和/或大脑炎症中起着重要作用，这可能是导致帕金森病（parkinson’s disease，PD）神经变性的关键因素之一。
TLR5可以识别鞭毛蛋白，鞭毛蛋白是目前发现的TLR5的唯一配体。具有鞭毛蛋白的L型细菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门菌等可被TLR5识别。有研究表明TLR5敲除小鼠表现出明显的鞭毛蛋白特异性免疫球蛋白损失，这些小鼠肠道中存在逃避免疫球蛋白包裹的变形杆菌，这些杆菌可穿透小肠绒毛，破坏结肠黏膜屏障。在体外，鞭毛蛋白特异性免疫球蛋白可以抑制细菌运动并下调鞭毛蛋白基因的表达。TLR5感应肠道微生物群的变化对于季节性流感疫苗接种的抗体反应是非常重要的，因为TLR5介导的鞭毛蛋白传感可直接促进浆细胞分化，刺激淋巴结巨噬细胞产生浆细胞生长因子。并且TLR5介导的对微生物群的感知也影响了对灭活脊髓灰质炎疫苗的抗体反应，揭示了肠道微生物群在促进免疫接种中的作用。此外，肠道细菌鞭毛蛋白对肠黏膜TLR5的激活可损伤肠屏障功能，这导致IBD肠道炎症恶化和持续的潜在机制。
TLR7、TLR8和TLR9高度同源，与其他TLR不同，它们在细胞内涵体中起作用，吞噬和包膜溶解后结合它们的配体，可识别微生物的核酸。TLR9识别细菌的CpG-DNA，激活B细胞和抗原提呈细胞（antigenpresenting cell，APC）的免疫刺激特性。TLR7位于X染色体，在自身免疫发展中起重要作用。大多数自身免疫性疾病具有强烈的性别差异，如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）主要影响女性。因此，性别特异性因素，如性激素、第二个X染色体的存在或缺失，以及性别特异性肠道微生物群，可能是导致这种差异的原因之一。利用TLR7依赖性系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）小鼠模型，分析饮食对肠道微生物群的影响，发现肠道TLR7依赖性罗伊氏乳杆菌的富集可以恶化小鼠的自身免疫表现。TLR7还介导抗病毒效应，TLR7与病毒感染细胞中的富含鸟嘌呤（G）和尿嘧啶（U）的单链RNA结合，当被病毒感染时分泌Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）释放增加。IFN-I能直接干扰病毒复制或间接增强NK细胞、B细胞和T细胞的杀伤能力，从而发挥抗病毒效应。当来源于外界的一些单链RNA被TLR7识别后，经过一系列级联反应，转录因子NF-κB、IRF被激活引起IFN、IL-1、IL-6、IL-12、TNF等多种炎性细胞因子分泌，从而发挥多种抗病毒效应机制。R837和R848是TLR7特异性的配体，这些配体可通过TLR7活化多种免疫细胞，从而发挥抗病毒作用。当呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）刺激BALB/c小鼠后，NF-κB被活化，TLR7的表达上调，与此同时细胞因子亦被释放。RSV感染RAW264.7细胞可通过诱导TLR3及TLR7的活化，诱导激活IFN-I的产生，从而产生抗病毒免疫反应。丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的感染可抑制TLR7的表达，TLR7的表达在慢性乙型肝炎患者的单核细胞来源的树突状细胞中亦较低。TLR7在变态反应性及免疫缺陷疾病中的功能是TLR7可识别病毒RNA，但在偶然的情况下也能被自身的RNA活化，引起自身免疫性疾病。TLR7在SLE的发病的过程中可能存在一定的作用，在狼疮肾小鼠模型中TLR7的含量与此病的风险直接相关。SLE患者活动期TLR7 mRNA表达的水平升高，两者成正相关。另有研究表明血清TLR7在胶原诱导的关节炎（collagen induced arthritis，CIA）模型组异常低表达。TLR7还可能具有负调控作用可抑制类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、滑膜炎发生，延缓关节病理性破坏，可有助于临床诊断，有可能成为RA治疗的潜在靶点。雾化吸入咪喹莫特可上调TLR7 mRNA的表达，使IL-12表达水平升高而IL-13表达水平下降，达到防治哮喘的目的。TLR7可能参与慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）的发病机制，TLR7在CML患者浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）中表达明显降低，这可能是pDC功能缺陷的主要原因。研究表明TLR7的激动剂能增强T细胞免疫和固有免疫诱导来抗肿瘤。咪喹莫特可通过局部用药来治疗早期皮肤恶性肿瘤。肿瘤细胞表面还表达多种TLR并与肿瘤细胞的生长转移有关。另外，TLR7可能通过上调NF-κB的表达，从而促进食管癌（鳞癌）的形成。TLR7不仅能快速识别病原体，在某种程度上还能区分是胞内的还是胞外来源病原体，胞外的病原体可被位于细胞表面的TLR所识别从而产生一些促炎性因子如IL-12。TLR能够识别多种非特异性、保守的微生物组分及相应的内源性配体，不仅在天然免疫中发挥着重要作用，同时在很大程度上参与特异性免疫的启动和调控，从而影响免疫应答的强度、类型、免疫记忆的形成与维持等。此外，TLR7可以介导细胞凋亡，有研究显示在中枢神经系统中TLR7介导神经细胞的凋亡。
TLR9的表达对于巨噬细胞有效清除胞内菌的感染是必不可少的，研究发现TLR9的缺失明显削弱了巨噬细胞的活化和杀菌能力。小鼠感染鼠伤寒沙门菌的实验中，TLR9的缺失并不会促进肠道损伤和感染播散，但会促使肠道损伤更为严重，并促进鼠伤寒沙门菌穿过肠黏膜屏障向肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏扩散。
（二）NLR与肠道微生物群的相互作用
NLR位于细胞质中，具有2个亚家族：含半胱天冬酶激活与募集结构域（caspase activation and recruitment domain，CARD）NLR（NLRC）和含热蛋白（pyrin）结构域NLR（NLRP）。NLRC亚家族的成员有核苷酸结合寡聚化结构域受体（NOD）1、NOD2、NLRC4、NLRX1、NLRC3和NLRC5。NLRP亚家族由14个具有pyrin结构域的蛋白质组成。NOD样受体对于识别细菌以调控健康的肠道微环境至关重要。多项研究表明，缺乏NOD1、NOD2或NLPR6的小鼠的细菌组成发生改变。
1.NOD1和NOD2
在NLR中，NOD1和NOD2是最先被鉴定出的，在病原体识别中发挥重要作用。相反，肠道菌群组成的改变和易位可以调节NOD1和NOD2的信号传导。在黏膜免疫系统中，NOD1和NOD2与配体结合，激活NF-κB通路。据报道，NOD1识别革兰氏阴性菌的d-谷氨酰内消旋-二氨基，NOD2识别胞壁酰二肽（肽聚糖的代谢物）。非侵入性幽门螺杆菌感染依赖于NOD2信号传导。NOD1对于防止非侵袭性艰难梭菌和沙门菌致病岛（Salmonella pathogenicity island，SPI）1缺陷型沙门菌突变体感染是必不可少的。NOD对共生菌有调控作用，在缺乏NOD2的情况下，普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）增加、炎症反应加剧、杯状细胞功能障碍和炎性基因异常表达。NOD1缺陷小鼠的拟杆菌、梭菌、肠杆菌科和节段丝状菌异常扩增。霍乱毒素的佐剂依赖于整合素αX阳性（CD11c+）细胞的NOD2识别共生细菌，并通过环磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）增强NOD2活性。
2.NLRC4
NLRC4是NLRC亚家族的另一成员，在上皮隐窝中表达并在肠道健康中发挥重要作用。NLRC4早期识别柠檬酸杆菌对于调节其定植和减轻肠道损伤是必需的。沙门菌感染后，IEC的神经元凋亡抑制蛋白与细菌配体如鞭毛蛋白结合，激活NLRC4形成炎症小体，进一步激活下游的半胱氨酸蛋白酶（caspase）-1或caspase-8。据报道，caspase-1的激活导致IEC死亡、IL-8和花生酸释放。另外，由NLRC4的下游信号致敏的caspase-8也具有消除IEC的能力。有趣的是，在这个过程中，caspase-8对沙门菌感染的保护和致病作用可同时发生。
3.NLRP3、NLRP6和NLRP12
NLRP3、NLRP6和NLRP12是先天免疫的调节剂。NLRP12是编码先天免疫负调节剂的基因，溃疡性结肠炎患者与NLRP12的低表达有关。NLRP12在小鼠体内的缺乏可增加结肠的炎症水平，降低微生物的密度，螺旋藻科等保护性菌株丰度降低，与结肠炎有关的菌株丰度升高。NLRP3是炎症小体的组成部分，肠道NLRP3过度活跃更可能维持动态平衡并对结肠炎和结直肠癌具有较强的抵抗力。IBD患者肠道炎症组织中miR-223的表达增加，抑制NLRP3在结肠和髓质细胞中的表达。而炎症单核细胞中的miR-223则可直接介导NLRP3的表达，从而减轻炎症细胞的活性并抑制结肠炎。NLRP3与肠道微生物群的相互作用也是至关重要的，NLRP3过度活跃可以增强固有层的单核吞噬细胞IL-1β的分泌，并促进菌群的重建，进而上调Treg细胞和抗炎反应。
由于许多PRR在免疫应答中发挥复杂且矛盾的作用，因此有必要探索大多数PRR在不同微环境下的基本识别机制，以及他们之间如何相互作用将共生菌从有害细菌中区分开来，以维持肠道动态平衡。总之，大多数PRR缺陷导致细菌群体组成异常。健康的先天免疫系统有助于肠道菌组成的优化，先天免疫系统的失调可能导致肠道菌群紊乱进一步导致疾病。