第一节　人类疾病转录组的概念及RNA提取的质量鉴定

一、人类疾病转录组的概念

传统的转录是指遗传信息从基因（DNA）转移到RNA的过程，即在RNA聚合酶（RNA pol）的作用下合成一条与DNA碱基序列互补的mRNA的过程。组成人类基因组的DNA大约是30亿个碱基对（bp），其中约有5%~10%基因被稳定转录，而编码蛋白质的基因只占不到2%，其余大约3%~8%的转录序列中绝大多数为非蛋白质编码转录，统称ncRNA。因此，随着RNA研究的深入，对转录的概念以及范围有了新的理解和定义。转录组指以特殊环境或特殊生理情况为依托，在某个细胞、组织以及生物体内所有基因转录产物RNA的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA及其他的ncRNA。ncRNA包括微RNA（microRNA，miRNA）、长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）以及环状RNA（circRNA）等。根据转录组所涵盖的内容不同，可以分为狭义转录组和广义转录组。狭义转录组单指所有mRNA的总和；广义转录组指生物体的细胞或组织在一个特定状态下转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和ncRNA。因此，现在转录组的分析研究，不仅包括特定生理和病理条件下细胞和组织中的mRNA的数量和种类的差异表达，而且还包括了ncRNA的数量和种类差异表达分析以及这些mRNA和ncRNA之间的相互交叉作用网络之间的分析。

应用于转录组学的研究技术已从消减杂交（subtractive hybridization）、差示筛选（differential screening）、cDNA代表性差别分析（representational difference analysis，RDA）以及mRNA差异显示（mRNA differential display）和表达序列标签（expressed sequence tag，EST）等，逐步发展到cDNA微阵列（cDNA microarray）、基因表达的系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、大规模平行测序技术（massively parallel signature sequencing，MPSS）和RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）等现代技术。RNA-seq技术由于具有高分辨率、高通量、高灵敏度和使用便捷等优点，已经逐渐发展为目前使用最广泛的转录组测序技术。

二、RNA提取和纯度的质量鉴定

转录组学分析研究中，第一步也是关键的步骤是在组织或混合的细胞样品中提取总RNA，分离提取的RNA纯度和完整度直接影响分析结果的准确性和可靠性。

（一）制备病理组织和细胞样品的RNA

在活细胞和死细胞以及标本取材和储存标本的过程中均有可能发生RNA降解。因此，转录组分析中获得高质量、高保全度的完整的总RNA，能更全面准确地反映标本所处的生理和病理条件下真实的转录组信息。RNA在核糖核酸酶（RNase）的作用下容易降解，如果不严格控制取材时所用的时间、处理标本和提取RNA时所用的器械和试剂，很容易导致标本中RNA发生降解，从而使标本中RNA完整性降低或丢失中低丰度RNA信息，而致结果误判或实验的失败。因此，制备实验材料（如细胞培养）和从组织标本中提取RNA时，要严格按操作流程规范取材，尽可能减少RNA的降解。如肿瘤切除后，应尽快将标本切成一定大小的小块组织，在-80℃冷冻保存，提取RNA时所用器械用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）处理后高温消毒以清除核糖核酸酶（RNase），在隔离的无菌环境中操作等。有研究报道，快速的转录物的降解主要发生在假基因（pseudogene）、短链ncRNA以及3’端扩展的未翻译区域的基因，比较典型的缓速转录降解主要发生在具有4~10个外显子和富含GC核苷酸碱基的蛋白编码基因。

为了减少甲醛固定的组织或石蜡包埋的组织中RNA发生不同程度的降解，在对其进行RNA转录组分析时，建议最好用新鲜的标本或按要求严格从冰冻保存的组织标本中提取总RNA。必要时也可从甲醛固定的组织、甲醛固定石蜡包埋（formalin fixed and paraffin embedded，FFPE）组织以及尸体解剖获取的组织中提取RNA。这时，可以选用商品化的专业RNA提取试剂盒对从FFPE组织中提取的RNA进行相关分析，如FFPE RNA purification Kit（Norgen），AllPrep DNA/RNA FFPE kit（Qiagen）和High Pure FFPE RNA Micro Kit（Roche）。

（二）激光显微切割获取标本RNA的提取

收集病理标本，从整体标本中提取RNA进行表达谱分析时，分析的结果只能反映整体组织层面不同样本之间在转录组上的表达差异以及通路的变化等信息，掩盖了组织中特定细胞群或亚群的转录组信息，而正是这些细胞，在病理变化中可能具有重要的诊断和治疗价值。特别是肿瘤组织包括实质细胞和各种间质细胞，这两类细胞的基因表达谱明显不同，因此从肿瘤组织中纯化提取特定细胞进行转录组分析有重要的科学意义。应用激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）技术能够从冰冻切片或FFPE组织切片上直接精确切取特定部位，对其进行转录组分析，从而达到高度敏感和高度特异的目的。如果肿瘤材料被非肿瘤组织（如基质和免疫细胞）污染，或者出现碎片和坏死区域，数据质量可能会受到严重影响，这时也可应用LCM技术精确获得特定感兴趣的区域（如癌旁组织）进行转录组分析获得重要的信息。

（三）RNA纯度的鉴定

由于RNA提取过程中可能存在基因组DNA、蛋白质以及碳水化合物的污染，这些将影响后续的RNA质量及表达谱分析结果。在提取RNA过程中不仅通过去除RNase来保证RNA的完整性，同时要用脱氧核糖核酸酶（DNase）消除制备文库前基因组DNA的污染。提取纯化RNA分离之后，使用NanoDrop、Qubit或生物分析仪器检查RNA的产量和质量。通过NanoDrop等仪器测定提取的RNA的OD260/OD280比值确定RNA的质量（比值参考值范围为1.8~2.0，小于1.8提示有蛋白质污染），OD260/OD230比值确定RNA的碳水化合物污染情况（比值参考值为2.3，小于2.3说明有碳水化合物污染）。并且将分离的RNA进行凝胶电泳，通过分析18S和28S带，确定RNA的完整性，如果28S和18S处各跑出清晰的一条带，且28S带的亮度是18S的1~2倍，无弥散现象时，可以判定分离的RNA完整。

提取的RNA纯度达到转录组分析标准后，按不同的转录组学分析方法的要求处理提取的RNA，进行相应的转录组学分析程序。