第二节　肝素类药物的药理作用

肝素是人体内固有的生物活性大分子物质，存在于肥大细胞（mast cell，MC）中。肝素又称普通肝素、标准肝素，它是一种硫酸化的糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG），是通过硫酸和羟酸共价结合后而形成的强酸，带有很强的负电荷，每个糖单元之间相互排斥，以保证肝素分子链不发生卷曲和交叉连接，维持线形结构。肝素除了具有抗凝血、抗血栓等药理作用外，还可能具有与抗凝无关的生物活性及药理作用。

一、抗凝作用

人体能够维持血液在血管中顺畅地流动，归功于机体对凝血系统灵敏的调节，其中包括抗凝系统、促凝系统以及纤溶系统之间的动态平衡。肝素的抗凝血活性主要是通过与AT的结合来发挥的。AT是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以灭活多种活化的丝氨酸蛋白酶，包括抗FⅡa、FⅩa、FⅨa、FⅪa、FⅫa。肝素与AT结合可以大幅提高AT抑制FⅩa和FⅡa的作用［9］。

众所周知，血浆的凝血反应是源于组织因子（tissue factor，TF）的释放，微量TF与凝血因子FⅦ相结合，活化FⅦ，形成TF/FⅦa复合物，随后即沿着TF/FⅦa复合物-FⅩa-Ⅱa途径引发凝血瀑布反应。凝血反应通过正反馈机制进行，最终的结果是按照几何级数进行扩大。若据此推算，1分子FⅪa能激活19分子FⅨ和870分子FⅩ，可生成12万分子的凝血酶和2亿分子的纤维蛋白单体。在正常情况下，人体为保持血液的顺畅流动，则需要经由以下数种比较完善的天然抗凝系统加以调节：①AT与内皮细胞管腔的硫酸乙酰肝素（heparan sulphate，HS）相结合，抑制FⅨa、FⅩa、FⅡa等被活化的丝氨酸蛋白酶；②由纤维蛋白吸附FⅡa，使之暂时隐蔽下来，不参与血液循环的凝血反应；③血管内皮细胞中的凝血酶调节蛋白（thrombomodulin，TM），可以产生双重抗凝作用；FⅡa与TM相结合后，可激活蛋白C（protein C，PC）生成活化型的蛋白C（activated protein C，APC），在蛋白S（protein S，PS）的辅助下灭活FⅧa和FⅤa；另外，与TM结合后的FⅡa本身也会丧失催化纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）转变成纤维蛋白和激活血小板的功能，使FⅡa从促凝物质转变成为抗凝物质；④组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）通过阻断TF/FⅦa复合物生成，发挥抗凝作用；⑤通过α₂-巨球蛋白，抑制FⅡa的生成和活化作用等［9］。

UFH中只有1/3的糖链含有与AT高亲和的戊糖序列，其中位于中心位置的3-O-硫酸葡糖胺片段是AT的直接结合位点。肝素抑制FⅩa仅需要该戊糖序列，而肝素抑制FⅡa还需要糖链长度不低于18个糖基。当AT与肝素接触后，发生构象的改变，暴露出反应中心环（reactive centre loop，RCL），RCL含有重要的蛋白酶底物序列，作用于凝血酶等丝氨酸蛋白酶活性部位，催化其灭活，灭活后肝素可解脱下来，继续催化游离的AT。肝素/AT复合物一旦形成，对激肽释放酶、FⅫa、FⅪa、FⅨa、FⅩa、FⅡa等凝血因子的抑制速度可增加1 000～2 000倍。肝素的抗凝作用机制见图2-1［10］。

通常认为，在上述机体天然的抗凝系统中，除与纤维蛋白结合后的FⅡa不被肝素影响之外，绝大部分的抗凝作用都可经由肝素予以加强和增速。肝素之所以能够发挥抗凝作用，除了具备分子结构硫酸化的特征外，还须借助于肝素依赖性抑制因子的辅助作用，例如AT、肝素辅因子Ⅱ（HCⅡ）、APC抑制物（activated protein C inhibitor，APCI）等，其中以通过AT的辅助作用最为强大，见图2-2。

在凝血过程中，有人认为最初生成的起始凝血酶可使血浆中的FⅧ、FⅤ活化成FⅧa和FⅤa，并且激活血小板，释放a-颗粒内的FⅤa。FⅧa和FⅤa作为FⅨa和FⅩa的辅助因子，可分别加速FⅩa和凝血酶的生成，显著增强凝血酶原的激活效应，形成更多的FⅡa。相反，肝素/AT复合物将抑制起始活化型凝血因子FⅡa，从而阻断FⅧ及FⅤ的激活，这是肝素抗凝活性的重要机制之一。此外，肝素可以强化APCI的活性；当与HCⅡ发生结合以后，肝素可不依赖AT发挥对抗FⅡa的作用。

TFPI有抑制TF/FⅧa复合物启动凝血的作用。TFPI由276个氨基酸残基组成，多肽键上的Kunitz-3功能区很可能就是肝素结合点。肝素不仅能促使血管内皮细胞释放TFPI，而且还能加大TFPI对TF/FⅦa复合物的抑制作用。有研究报道，当给予肝素静脉注射之后，受试者血浆内的TFPI浓度可提高2～10倍。

1986年，那屈肝素作为第一个LMWH制剂开始用于治疗静脉血栓栓塞，获得良好效果。LMWH相较于UFH具有一系列显著优点，如抗凝血效果好、出血反应少、生物利用度高、注射吸收好等。肝素的抗FⅡa活性和抗FⅩa活性是相等的，而LMWH的抗FⅩa活性/抗FⅡa活性比值为4∶1～2∶1，或更大。其作用机制与肝素一样，均依赖于AT。肝素的抗凝作用主要体现在抑制FⅡa和FⅩa，依靠肝素的戊糖结构和AT的结合。肝素结合AT能够增强对FⅩa、FⅡa的抑制能力，且肝素只有直接结合FⅡa才可以将其抑制作用发挥出来，为此要求肝素分子的长度必须足够。然而，肝素对FⅩa的抑制作用不需要与其结合，故没有规定对肝素最低分子量的要求。LMWH本身具备较短的糖链，多数分子长度均比18个单糖长度短，故对FⅡa的抵抗作用明显比FⅩa低。

二、其他抗栓作用

肝素类药物除了主要作用于内源性凝血途径上的凝血因子之外，对纤溶系统也发挥了一定的作用。随着血栓形成，机体为保持血流通畅，立即启动由纤溶酶原激活物（plasminogen activator，PA）激活纤溶酶引发的纤溶系统，以快速溶解纤维蛋白和血栓。纤溶酶原激活物主要包括组织型纤溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，t-PA）和尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-plasminogen activator，u-PA）等。整个纤溶过程，既可以由t-PA启动，也可以被FⅫa活化激肽释放酶原、激肽释放酶再激活未经活化的u-PA启动。经应用分子生物学技术验证，t-PA重链的F区域和K₂区域均是与肝素发生结合的功能区域。肝素及其组分对于这两条启动途径均有促进作用，尤其是LMWH的作用更明显。其重要的作用机制是加强纤溶酶原激活物的功能，可归纳为以下几点：①促使血管壁或血液中其他的细胞成分直接释放内源性PA；②能使APC促进PA的释放；③进一步增加PA合成；④阻断纤维蛋白单体的聚合作用，改变其稳定性；⑤修饰纤溶酶原激活物抑制物（plasminogen activator inhibitor，PAI）的活性；⑥修饰APC活性；⑦激活纤溶系统的FⅫa途径，产生u-PA的启动作用，从而促进血栓溶解［9］。

（一）激活纤溶系统

肝素既能提高血浆PA浓度，也能抑制PAI，从而加强t-PA和u-PA的溶栓作用，进而增进血栓的溶解，见图2-3［11］。

（二）保护血管内皮细胞［12］

血管内皮细胞是肝素的储存库。肝素进入血液循环后，立即被内皮细胞摄取，其含量可达血浆内浓度的100余倍。正常时内皮细胞表面负电荷应为-160mV，若转变成正电荷而达到+280mV时，就很容易形成血栓。实验证明，肝素带有很强的负电荷，外源性肝素可使受损的内皮细胞表面恢复负电荷，即使较小剂量的肝素也能维持内皮细胞功能并且防止其脱落，注射一次肝素后即能使这种抗凝作用持续数天。内皮细胞表面所结合的肝素及其组分，还可使内皮细胞释放出内源性类肝素物质，并有助于进一步加强肝素的抗血栓作用。

三、非抗栓作用

（一）抗炎作用

炎症是机体对伤害性刺激产生的一种保护性病理生理反应，在不同反应时相中有多种生物学因素参与。20世纪40年代，就有研究者发现肝素有抗炎作用，随后一些研究也相继证明了这一发现，究其机制，可能与下列因素有关。

1.肝素可中和多种致炎因子，如组胺、5-羟色胺、透明质酸酶、缓激肽、白细胞趋化因子、通透因子等化学介质。Keller发现，肝素中和组胺1mg、5-羟色胺4mg的需要量分别为4mg和15mg。

2.肝素可与纤维连接蛋白（fibronectin，Fn）相结合，从而增强网状内皮系统对异物或病原体的吞噬作用和吞饮作用，及其易于提升分解消化异物的能力，因而有人又把肝素称为网状内皮系统辅助因子；目前已知Fn表面的肝素受体将会参与Fn的调理作用；也有研究者认为，肝素的抗炎作用与能够激活增强网状内皮系统的吞噬活性有关，即应用小剂量的肝素就能提升网状内皮系统的活性。

3.肝素可抑制中性粒细胞激活，减少氧自由基（O、H₂O₂、OH）生成，促使超氧化物歧化酶释放，以及中和已经生成的氧自由基，从而减轻组织器官的损伤。

4.肝素带有较强的负电荷，故能与抗原或抗原抗体复合物相结合，抑制某些感染性病毒对细胞的吸附、渗入及增殖等。

5.肝素对某些毒素可产生灭活作用，在国内曾经有人报道［13］，内毒素血症大鼠给予肝素钠注射液后，多配体蛋白聚糖1抗体、E-选择素等炎症因子水平降低，肺组织病理学损伤减轻，表明肝素酶被抑制后糖萼的破坏明显减轻，从而肺组织炎性反应和水肿明显减轻。另外，国内还有一组分组对比的实验研究报道［14］，采用LD₇₅的O₁₁₁B₄大肠埃希菌内毒素建立的小鼠实验性内毒素血症模型，来研究肝素对于内毒素血症产生保护作用。其结果是只使用生理盐水作对照组的存活率为33.33%，而直接使用肝素治疗组的存活率为63.64%，使用肝素1.5IU/20g小鼠治疗组的存活率为75.02%，应用肝素3.0IU/20g小鼠治疗组的存活率为79.17%；同时，研究者进一步分析研究，采取肝素与内毒素同时注射的存活率为79.17%，采用皮下注射给药的存活率为77.27%，通过此实验研究进一步确认肝素可对内毒素血症患者产生明显的保护效应。

6.肝素还可通过增强机体的抗补体作用、改善微循环、增加肌肉组织血流量、抑制脂质过氧化、减少脂质过氧化物生成等，从而获得镇痛、消炎、减少组织损伤，以及抗过敏作用等。

7.Pomin ［15］对UFH/LMWH在一些炎症中的作用进行了详细综述，主要包括胰腺炎、哮喘、肺炎等。新近发现肝素对炎症性贫血也有效。炎症或慢性疾病贫血是在炎症时，生物体内的铁调素高表达，导致炎症性贫血，研究表明，肝素以及非抗凝肝素（N-乙酰化肝素衍生物和肝素糖醛酸C2-C3裂解的衍生物）可抑制体内铁调素的表达，从而缓解炎症贫血。

研究表明，口服依诺肝素可以改善由硫酸葡聚糖钠引起的急性结肠炎小鼠的腹泻和便血，发现在此过程中，依诺肝素通过减少M1巨噬细胞的数量和抑制IL-1β的表达，同时增加M2巨噬细胞的数量来缓解小鼠的结肠炎症状［16］。还有研究发现，肝素可通过降低干扰素γ、IL-13、IL-5、嗜酸性粒细胞趋化因子及IL-17A/F水平来减轻由螨诱导的BALB/c小鼠气道炎症［17］。

（二）抗肿瘤作用

肿瘤患者由于病理生理因素，血液呈高凝状态，易患静脉血栓栓塞。静脉血栓栓塞是肿瘤患者常见并发症，目前，低分子肝素是肿瘤患者静脉血栓栓塞的标准治疗药物。目前的研究发现肿瘤的转移很可能与以下因素相关：①患者的高凝状态，微血栓形成；②出现微血管新生；③纤溶蛋白活性略低；④自然杀伤细胞（natural killer cell，NK cell）功能低下等。肝素能抑制血栓形成和阻止肿瘤细胞黏附于血管内皮，故有可能防止肿瘤转移。

晚期肿瘤患者常表现出血液高凝，即肿瘤细胞通过产生促凝血蛋白、炎症细胞因子、黏附分子激活止血系统［18］；同时，促凝血蛋白可直接作用于内皮细胞与肿瘤细胞来参与肿瘤的生长。临床数据证明抗凝药物的使用可以减缓肿瘤的进程，例如在对小细胞肺癌患者进行放化疗的同时联合给予抗凝药物华法林可延长患者的生存期［19］。肝素具有同样的效果，1994年Lebeau等［20］发现皮下注射肝素有助于提高小细胞肺癌患者的生存率。

肿瘤新生血管形成是肿瘤组织生长与转移的必要条件。1971年美国科学家Judah Folkman提出“肿瘤血管新生”学说，该理论认为新生血管为肿瘤提供生长所必需的营养物质，如果通过药物抑制肿瘤血管生成，也就阻断了肿瘤获取营养物质的途径，进而达到抑制肿瘤生长的目的［21］。肿瘤细胞可通过释放一系列生长因子（如血管内皮生长因子）与血管内皮细胞上特异性受体相结合，促进肿瘤血管生成。肝素可以下调血管内皮生长因子的表达，抑制新生血管的形成［22］。

肿瘤细胞脱落后进入血液循环系统，其中的小部分肿瘤细胞可与血小板结合形成微血栓，在微血栓的保护下肿瘤细胞能够逃避免疫系统的攻击，进而到达机体其他部位形成转移灶［23］。选择素在肿瘤细胞与血小板形成微血栓以及介导肿瘤细胞与血管内皮细胞黏附过程中发挥着重要作用。机体内存在3种选择素，分别为P-选择素、L-选择素和E-选择素。肝素及其衍生物可干扰P-选择素和L-选择素介导的血小板、白细胞与肿瘤细胞之间的黏附，阻断肿瘤细胞进入血液循环发生转移［18］。P-选择素主要介导肿瘤细胞与血小板黏附过程［24］，L-选择素在白细胞与肿瘤细胞黏附过程中发挥着重要作用。Borsig等［25］研究发现在P-选择素缺陷小鼠体内，血小板不能黏附到肿瘤细胞表面，肿瘤生长显著减慢，静脉注射肿瘤细胞肺转移情况减少；L-选择素缺陷小鼠体内结肠癌转移减弱，进一步研究发现在P-选择素、L-选择素双缺陷鼠中肿瘤转移进一步减弱［26］。

肝素亦具有抑制上皮细胞-间充质转化（EMT）的能力。在肿瘤发展过程中，EMT通过增强细胞的迁移性、侵袭性与抗凋亡能力，参与肿瘤的发生与转移［27］，肿瘤干细胞能够在间充质细胞和上皮细胞状态之间进行转换，被认为是转移、化疗和临床复发过程中的关键因素。Ponert等［19］研究表明在治疗浓度下，UFH与LMWH可以消除或部分减少胰腺癌和前列腺癌细胞的EMT过程，使肿瘤侵袭能力减弱。

抗凝治疗有助于控制肿瘤生长和阻碍其转移，临床上采用肝素辅助化疗方案的理论依据为：①配合肝素治疗，有抑制某些实验动物肿瘤生长的作用，比如可使肿瘤生长周期M期延长；②配合肝素治疗，可改变或影响细胞膜及其代谢功能，促使抗肿瘤药物容易进入肿瘤细胞内；③使用肝素还能阻断凝血酶，且易于控制和进行解救［28］。

（三）参与免疫介导

肝素的抗补体作用最早见于1929年Ecker及Gross等人的报道，当时认为，抗补体作用可能是肝素作用于补体的第三或第四成分（C3，C4），使其灭活。1978年，Weiler等［29］实验研究证实，肝素对C3转化酶（C3bBb）的生成有调节作用。近来的许多研究又进一步确定了这一发现，并且采取分子生物学研究方法证明了肝素的另外抗补体机制。目前认为，肝素可作用于补体系统的经典途径、旁路途径和调控系统，以发挥抗补体作用。

有研究者利用肝素链寡糖体进行研究，其结果初步证明在肝素分子上可存在相应的抗补体受体，仅有4～14个糖单元的肝素分子可具有抗补体作用。随着肝素相对分子量增加，其抗补体的作用将呈指数级上升，并随硫酸化程度的增加而增大；AT高亲和力肝素组分、低亲和力组分和无抗凝活性组分，同样都具有抗补体作用，并提示肝素本身的抗补体作用与抗凝活性无关。有的学者还经实验研究证实，在抑制眼镜蛇毒因子（cobra-venom factor，CoVF）引起的补体激活方面，普通肝素的作用可较修饰肝素的作用增强至2倍以上；而且抑制豚鼠血清中CoVF导致的补体激活则需要肝素量较人血清多达4倍以上；再则，抑制酵母聚糖导致的补体激活，肝素在人血清中要比豚鼠血清中的作用强至10倍以上。因此，有些研究者认为，肝素能够有效地调控人类的补体活性，并且期望可以借此开发出新的抗补体制剂。