第一章　肝素类药物的发现与发展

肝素是一种硫酸化糖胺聚糖，由糖醛酸和葡萄糖胺的衍生物构成的约32种二糖单位连接而成，为天然来源的抗凝药物，广泛应用于预防和治疗血栓栓塞性疾病。由于各种取代基的位置和数量不同，其相对分子量（Mr）也存在差异，分别为3 000～30 000Da，平均为15 000Da。肝素是第一个被发现和分离出来的抗凝药物，作为抗凝药物治疗的先驱者，如同许多伟大的发现一样，其问世及发展充满了戏剧性。

随着对肝素抗凝作用机制研究的不断深入，以肝素为母体而开发的各种衍生物如低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）、超低分子肝素（ultra-low molecular weight heparin，ULMWH）被不断开发出来，其间历经几十年，发展之路崎岖，充满了艰辛、努力和智慧。LMWH或ULMWH是由肝素经不同方法解聚制备而成的一系列分子量较低的产品。LMWH相对分子量范围一般在3 000～8 000Da，平均相对分子量约5 000Da，其药效学及药代动力学特性与肝素不同。

一、肝素的发现

早在1911年，Maurice Doyon等就从肝脏中分离得到一种水溶性抗凝物质，由于第一次世界大战爆发，他的研究也因此中断。

1916年，Jay McLean还是美国约翰·霍普金斯大学生理学实验室的二年级医学生，师从于生理学家William Henry Howell。当时Howell教授旨在寻找一种能够促进凝血的物质去解决手术中出现的大出血问题，他认为存在于血小板和白细胞中的脑磷脂（cephalin）能够依靠钙离子激活凝血酶原，从而发挥中和抗凝血酶的作用。McLean通过乙醚提取法，获得不同组织来源的脑磷脂，证实其具有促凝活性［1］。McLean在研究中还发现，分别来源于心脏和肝脏组织的乙醚提取液经60℃无水乙醇沉淀，获得的心磷脂（cuorin）和肝磷脂（heparphosphatid）具有抗凝活性，贮存约3个月后，抗凝活性更为明显。McLean将此发现向Howell教授报告，当时Howell表示怀疑，考虑提取物被盐污染。经McLean重复实验证明，肝脏提取物中确实存在一种强力的抗凝物质。后来，McLean在宾夕法尼亚大学继续进行脑磷脂研究，而Howell教授在McLean完成学业后，继续研究这种新抗凝物质。1918年，他与另一位学生Holt采用包括乙醚提取、丙酮沉淀、三氯甲烷溶解、乙醇沉淀等步骤的复杂方法从犬肝脏中分离出抗凝物质，因这种物质来源于肝脏，将其命名为“肝素（heparin）”，是按传统古希腊文“Hepar（肝脏）”来命名肝脏的提取物。但提取物中实际的肝素含量很低，大部分为磷脂类物质［2］。为提高肝素收率，Howell教授将提取方法改为水提取、丙酮沉淀，此即首个肝素粗品。1928年，Howell确认肝素为含硫的糖类［3］。

肝素的发现者迄今依然有争议，虽然是Jay McLean发现了肝素，但是当时外界却认为是他的导师Howell教授发现了肝素，这或多或少影响了师徒情谊。据说，McLean在1940年后向导师Howell教授发起了荣誉争夺战，McLean在1959年去世时，他的悼词中写道“他发现了肝素”。直到1967年，JAMA（《美国医学会杂志》）发表社论“Jay McLean（1890—1957）：Discoverer of Heparin”才在一定程度上终结了争议。现在大多数学者和媒体认为是Jay McLean发现了肝素。

二、肝素的工业化生产

肝素钠最早的工业化生产始于20世纪20年代，由Howell实验室的Hynson及Westcott等完成。最早提取肝素钠的动物组织来源是犬肝脏。当时提取到的肝素纯度极低（1%～2%），活性仅5U/mg左右，因毒性太大不能用于动物或人体研究，主要用于实验室体外研究。

由于肝素最初来源于犬肝脏，不适合大规模制备。20世纪30年代加拿大多伦多大学生理系的Charles Best（与Frederick Banting共同发现了胰岛素）和Scott发现牛肺中也含有大量肝素，于是将提取组织由犬或牛的肝脏改为牛肺。牛肺价格低且收率高。同时，他们借助化学方法完成了结晶性肝素钡盐的制备，结晶技术使肝素的效价和构成更为匀质，所以肝素质量的稳定性可以得到保证［4］。肝素钡盐唯一的缺点是生产成本较高，所以Charles将肝素钡盐转换成钠盐，解决了规模化生产的问题。Charles和Scott在20世纪30年代就肝素生产所做的工作受到高度赞赏，认为他们开创了肝素工业化生产的新时代。

1935年，肝素钠在加拿大进入临床试验。同期，瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所的Erik Jorpes实验室也验证了自己的肝素提纯技术，Jorpes对肝素的化学结构解析作出很大贡献。随后，肝素开始在斯德哥尔摩的Vitrum公司生产。

1939年第一个药用肝素钠在美国上市，由Roche Organon公司从牛肺中分离纯化制备生产，商品名为“Liquaemin”。其生产工艺与Charles和Scott的生产工艺类似，由约20步连续工艺步骤组成，包括某些极端过程，如在碱性溶液中95℃加热、酸化至pH 2以下等，最后经乙醇沉淀获得产品。这些过程虽并非专门设计，但仍有效地去除了病毒，保证了肝素不被病原性病毒污染。

直到20世纪50年代，牛肺一直是肝素生产的主要原料，此后，Vitrum公司改用猪小肠黏膜作为生产肝素的原料。一个原因是大量腐败牛肺的处理、贮藏和提取存在一定难度，且在组织降解过程中会引起肝素的降解，影响肝素的收率。另一个原因是原料的可获得性，牛肺在动物饲料中用量的增加提高了获得牛肺的成本，而猪小肠黏膜作为制造香肠肠衣的副产品易于获得，同时猪小肠黏膜是一种较为干净的原料，降解工艺也更简单，成为理想的替代品。

三、肝素的结构解析

1916年由McLean分离到的抗凝物质被认为是一种磷脂。20世纪20年代，随着对提取工艺的改进，Howell认识到磷脂对于肝素来说其实是杂质成分。1928年，Howell确定肝素是一种含硫的糖类。1935年，Jorpes鉴定出肝素的主要糖结构是糖醛酸和己糖胺，物质的量之比是1∶1，分子结构中的硫酸基含量约占总量的40%，Jorpes是第一个认识到硫酸基团是肝素分子重要特征的学者，并计算出每个双糖单位含2.5个硫酸基［5］。

肝素化学结构鉴定的难点主要在于糖醛酸成分的鉴定。由于肝素耐酸水解，水解时不得不用相当剧烈的条件，这随之破坏了大部分释出的糖醛酸。直到1946年，Wolform和Rice设计了新的水解条件，保护了释出的糖醛酸，才鉴定出了肝素的D-葡糖醛酸结构。

1962年，Cifonelli和Dorfman在肝素的酸水解产物中发现了L-艾杜糖醛酸。随着分析手段的不断提高，最终证明艾杜糖醛酸才是肝素中主要的糖醛酸。

20世纪50—70年代的系列研究确定氨基葡糖和糖醛酸的连接键构型及连接位置［6］。艾杜糖醛酸和葡糖胺残基通过α-1，4键与糖链中相邻糖残基相连，葡糖醛酸则通过β-1，4键与相邻糖残基连接［7］。

1976年，Johnson和Mulloy证实了肝素结构的不均一性，并确定了肝素的相对分子量范围为5 000～35 000Da。

1980年，Lindahl与Leder合作阐明了肝素与抗凝血酶（antithrombin，AT）高亲和力结合所必需的3位O-硫酸基团。Lindahl等最终证实肝素与AT结合的特异五糖序列为GlcNAc（6S）/（6S）-（1→4）-GlcA-（1→4）-GlcNS（3S）/ GlcNS（3S，6S）-（1→4）-IdoA（2S）-（1→4）-GlcNS（6S）。该序列是肝素与AT结合并发挥抗凝血活性的关键位点［7］。

1983年Choay等合成出了肝素独特的五糖结构，这是肝素发展史上的又一个里程碑式事件。

四、低分子肝素的发现

低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）的发现得益于化工技术的进展，我们逐渐可以通过不同方法将肝素依据分子量进行分离。1976年E. A. Johnson等人采用凝胶过滤法制备得到高、中、低3个分子量范围的粗分离组分，并招募志愿者，将2种高、低分子量的肝素（平均分子量分别为22 000Da和9 000Da）皮下注射给健康志愿者，发现分子量对抗FⅩa活性有显著影响。经抗FⅩa活性测定，低分子量组分在血液中的水平和保留时间，远超高分子量组分或普通肝素［8］。20世纪70年代，数家制药公司开始将低分子肝素作为候选药物进行制备和研究。

1976年，由法国Choay研究所研究发现了世界上第一个低分子肝素（LMWH），并在1978年获得专利，这就是那屈肝素。因专利限制，各生产商采用的降解方法不同，主要有亚硝酸盐降解法、苄基化后进行碱解聚法、过氧化解聚法、肝素酶降解法等。到20世纪80年代，已开发出4种主要产品：那屈肝素（Fraxiparin®，GlaxoSmithKline公司）、亭扎肝素（Innohep®，DuPont公司）、依诺肝素（Lovenox®，Sanofi公司）和达肝素（Fragmin®，Pfizer公司）。20世纪80年代中期，又有4种产品问世，分别是舍托肝素钠（Sandoparin®，Novartis公司）、瑞肝素钠（Clivarin®，Vetter Pharma-Fertigung GmbH &Co.KG公司）、贝米肝素钠（Zibor®，Laboratorios Farmacéuticos ROVI，S.A.公司）、帕肝素钠（Fluxum®，Alfa Wassermann）。目前，已有10多个LMWH制剂上市，LMWH的问世堪称抗凝治疗领域里程碑式的重大发现，影响深远。临床常用的4种LMWH的制备方法与理化性质如表1-1所示。

五、肝素/低分子肝素的作用机制

1925年，Howell认识到肝素需在某种血浆共因子存在时才能发挥抗凝作用，但并不了解此血浆共因子的性质。直到20世纪60年代，Abildgaard纯化出抗凝血酶，并指出它与血浆共因子是同一种物质。

1973年，Damus等人提出肝素的作用机制是与抗凝血酶结合，使其对凝血酶抑制速率提高1 000～2 000倍，Damus等还发现，肝素也增强抗凝血酶对其他蛋白酶（如凝血因子FⅩa、FⅨa和FⅪa）的抑制作用。Roserberg等提出，肝素诱导抗凝血酶发生构象变化，从而大大加快了与其他丝氨酸蛋白酶的反应速率。

1976年，Roserberg等对肝素与抗凝血酶的混合物进行蔗糖密度分离，发现仅有部分肝素与抗凝血酶结合（30%～50%）。同一时期，另一个研究方向是不同分子量的肝素组分在不同效价体系中的活性。按照药典的效价测定方法，肝素的抗凝活性随着分子量的减少而降低，但科学家意外发现低分子肝素组分在抗FⅩa活性分析中仍保留其活性。Anderson等进一步研究证实低分子肝素组分增强凝血酶抑制的能力很小，但仍保留高抗FⅩa活性。以上研究结果表明：肝素对凝血酶和FⅩa这两种蛋白酶的作用机制不同，对凝血酶的抑制要求肝素链有一定长度。Lane与Lindahl等研究指出，肝素增强凝血酶抑制所需的最小链长为18个糖单元。

六、肝素/低分子肝素的临床研究

20世纪30年代早期的肝素制剂，由于纯度低，动物实验发现其毒性很大，限制了其临床应用。1933年Charles制备的肝素制剂，活性达250U/mg（多伦多单位），经动物实验发现在犬体内无毒，后续临床试验也很快展开，由于纯度问题，注射肝素后约一半患者发生不良反应，包括恶心、呕吐、寒战等。Charles进一步制备了肝素钡盐，纯度是当时肝素制剂的2倍，患者使用时不良反应显著降低。

20世纪60年代初期，肝素的疗效已被确认，主要用于防治深静脉血栓。1960年，Barritt和Jordan［9］将一项有重大影响的抗凝药物临床试验研究发表在《柳叶刀》。急性肺栓塞且无抗凝禁忌证的患者被随机分配到肝素+醋硝香豆素抗凝组（n=16）和不抗凝组（n=19）。主要终点是肺栓塞死亡，次要终点是非致死性复发和其他原因导致的死亡。1958年，研究者对患者进行了中期分析：不抗凝组中有5人死于肺栓塞，抗凝组中无死亡病例。由于中期分析时复合终点改善非常显著，研究者决定把所有新招募的患者都分到抗凝组，这些患者均未发生肺栓塞死亡，只有1例非致命性复发。这项开创性研究对该领域产生了深远的影响，首次证实了使用肝素和维生素K拮抗剂（vitamin K antagonist，VKA）进行抗凝治疗能够显著降低肺栓塞死亡和复发风险，具有里程碑意义。

20世纪70年代中期，共有27个临床试验研究论文发表，其中最大的一项是Kakkar［10］发表在《柳叶刀》的国际多中心随机试验。4 121名接受各种择期大手术的患者随机分为两组，治疗组（n=2 076）给予小剂量肝素（5 000IU，每日2～3次），对照组（n=2 045）不使用肝素。治疗组80例死亡，对照组100例死亡，分别有66%和72%的病例进行了尸体解剖，发现死于急性大面积肺栓塞者分别有2例和16例（P<0.005）。部分患者（治疗组625例，对照组667例）进行了125I-纤维蛋白原检测，以诊断深静脉血栓形成（DVT），治疗组DVT发生率明显低于对照组（7.7% vs 24.6%；P<0.005）；30例在尸检时发现DVT，治疗组6例，对照组24例（P<0.005）。Kakkar总结道，小剂量肝素预防术后致命性肺栓塞非常有效，未发生严重出血。标准给药方案是术前2小时给予肝素5 000IU，然后每8～12小时给药一次，用药7天。

LMWH的首次临床研究是Kakkar［11］等于1982年报道的，应用那屈肝素（fraxiparin）预防DVT，按每日1次或2次分别给予100名和50名两组患者，结果表明这两种给药方案都有效，特别是每日1次给药，100名患者中有97人未发生DVT，且出血倾向没有增加。虽然未设对照，但此次开创性的试验，为20世纪80年代LMWH和低剂量普通肝素（UFH）的比较研究铺平了道路，也首次显示LMWH每日1次给药即可有效预防DVT，患者用药方便，明显优于UFH。

20世纪80年代中期，研究者进行了皮下注射较高剂量LMWH治疗已形成的静脉血栓的临床研究。20世纪90年代的数项研究证实，LMWH对已形成的静脉血栓有效，其主要优点是可在门诊持续治疗。1996—1997年，四项大型随机临床试验研究论文的发表，证实院外、不监测皮下注射LMWH与院内静脉注射普通肝素治疗血栓性疾病的疗效和安全性相当。这些试验结果改变了血栓形成的临床管理，LMWH逐步取代普通肝素用于血栓性疾病的预防和治疗。

七、磺达肝癸钠的发现

20世纪80年代初，五糖片段被确认为肝素的抗凝血酶关键结合域。在Choay等阐明并合成五糖结构的基础上，法国Sinay教授的研究小组，经70多步化学反应，化学合成了此五糖片段及其甲基苷。生物活性测试表明，五糖片段的抗凝和溶栓性能与其甲基苷十分相似。1988年，该五糖片段的甲基苷获得化合物专利（专利号：EP0084999B1）。2001年，该五糖片段的甲基苷，作为新一代的抗血栓药物上市，命名为磺达肝癸钠（Arixtra®，Glaxo Smith Kline公司）。

2003年发表的一项开放性试验纳入2 213例急性症状性肺栓塞患者，随机分配到普通肝素组和磺达肝癸钠组，结果显示两者安全性和有效性不相上下。2004年，Büller等发表了一项多中心随机双盲试验结果，在154个中心纳入2 205例深静脉血栓患者，结果表明磺达肝癸钠和依诺肝素的安全性和有效性相似。2005年发表的OASIS-5［12］研究评估了磺达肝癸钠对非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者缺血事件和出血并发症的影响。共有20 078名急性冠脉综合征患者被随机分配接受磺达肝癸钠或依诺肝素治疗。结果表明磺达肝癸钠治疗显著降低了患者大出血风险，降低了远期死亡率，而且在缺血事件保护方面效果与依诺肝素相当。

随着临床试验的不断开展，磺达肝癸钠在临床治疗上的优势不断显现，有望在静脉和动脉血栓栓塞性疾病的预防和治疗中发挥重要作用。

（姚笑睿　刘晓琦　劳海燕）

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